原纤维蛋白1在猪耳软骨细胞工程化软骨组织中的表达及作用
董可欣康宁孙可欣刘霞蒋海越
本文来源：《中华整形外科杂志》年6月第36卷第6期
DOI:10./cma.j.cn-0316-
作者单位：中国医学科学院北京协医院研究中心
通信作者：刘霞，Email:liuxia
psh.pumc.edu.cn引用本文
董可欣,康宁,孙可欣,等.原纤维蛋白1在猪耳软骨细胞工程化软骨组织中的表达及作用[J].中华整形外科杂志,,36(06):-.DOI:10./cma.j.cn-0201-
目的探讨原纤维蛋白1（FBN1）在猪耳软骨细胞工程化软骨组织中的表达情况，以及过表达FBN1后对软骨细胞表型和细胞外基质表达的影响。
方法取3只长枫杂交猪单侧耳廓软骨，提取软骨细胞扩增至第2代，以6.0×/ml的密度（μl）接种于直径为10mm、厚2mm的聚羟基乙酸-聚乳酸（PGA-PLA）支架材料上，体外培养5周，构建9块细胞材料混合物组织块；将6块细胞材料混合物植入3只裸鼠体内，每只2块，培养10周，构建工程化软骨组织6块。HE染色分别检测3块体外培养5周的细胞材料混合物及裸鼠体内培养10周后的组织工程化软骨形态；取3块2cm×1cm大小的另一侧猪耳软骨组织及3块1.0cm×0.5cm大小的工程化软骨组织提取RNA，通过qPCR检测二者FBN1mRNA表达差异；取0.5cm×0.5cm大小的另一侧猪耳软骨组织及工程化软骨组织各3块，利用免疫组织化学染色检测二者FBN1在蛋白水平的表达及分布差异；在第2代猪耳软骨细胞中转染空载体质粒及FBN1过表达质粒，利用实时荧光定量PCR检测软骨细胞外基质相关基因的表达变化，实验重复3次。所得数据用GraphPadPrism6.0进行双尾非配对t检验分析，P0.05为差异具有统计学意义。
结果HE染色结果显示：体外培养5周时，工程化软骨组织中可见大量软骨细胞及小的软骨陷窝，体内培养10周后，工程化软骨组织中形成明显软骨陷窝；工程化软骨组织FBN1mRNA的相对表达量（0.±0.）较正常猪耳软骨组织（0.±0.）显著降低，差异有统计学意义（t=4.，P=0.）；正常组织中FBN1分布于软骨陷窝及软骨膜处，而工程化软骨组织中多分布于软骨膜处，越接近软骨组织中心越少；FBN1过表达组中FBN1mRNA相对表达量为0.±0.，而空载体对照组为0.±0.，差异具有统计学意义（t=9.，P0.）；过表达FBN1后软骨细胞SOX9、COL2A1、ACAN等软骨相关基因的相对表达量与对照组相比分别增加了1.±0.、1.±0.、1.±0.倍，差异有统计学意义（t=3.、3.、3.，P=0.、0.、0.）。
结论猪耳软骨工程化软骨组织中FBN1mRNA表达量及蛋白表达量显著低于正常耳软骨组织；体外实验显示FBN1促进软骨细胞COL2A1、ACAN等软骨相关基因的表达。
组织工程；软骨；原纤维蛋白1；软骨细胞
基金项目：国家自然科学基金（）；中国医学科学院医学与健康创新工程项目（-I2M-1-）
Theexpressionandfunctionoffibrillin1inengineeredcartilagetissueconstructedwithpigauricularchondrocytes
DongKexin,KangNing,SunKexin,LiuXia,JiangHaiyue
ResearchCenterofPlasticSurgeryHospital,ChineseAcademyofMedicalSciencePekingUnionMedicalCollege,Beijing,China
Correspondingauthor:LiuXia,Email:liuxia
psh.pumc.edu.cnObjectiveToinvestigatetheexpressionoffibrillin1(FBN1)inengineeredcartilagetissuewhichisconstructedwithpigauricularchondrocytes,andtheeffectofoverexpressionofFBN1onchondrocytephenotypeandextracellularmatrixexpression.
MethodsTakethreeChangFenghybridpigs’unilateralauriclecartilage,extractchondrocytesandexpandtothepassage2,theninoculateatadensityof6.0×/ml(μl)ontoPGA-PLAscaffoldmaterialswhosediameteris10mmandthicknessis2mm,thencultureinvitrofor5weekstoconstruct9piecesofchondrocyesandmaterialsmixturetissues;implant6piecesinto3nudemice,2pieceseach,culturefor10weeks,construct6piecesofengineeredcartilagetissue.HEstainingwasusedtodetectthemorphologyof3piecesofchondrocyesandmaterialsmixturetissuesculturedinvitrofor5weeksandtissueengineeredcartilageafter10weekscultureinnudemice;take3piecesofpigearcartilagetissueof2cm×1cmsizeand3piecesofengineeredcartilagetissuesof1.0cm×0.5cmsize,extractRNA,anddetectthedifferenceofFBN1mRNAexpressionbyqPCR;immunohistochemicalstainingwasusedtodetectthedifferenceinproteinexpressionanddistributionofFBN1between3casesoftheothersidepigearcartilagetissueandengineeredcartilagetissuewithsizeof0.5cm×0.5cm;transfectedemptyvectorplasmidsandFBN1overexpressionplasmidsintothepassage2generationofpigauricularchondrocytes,andusedqPCRtodetecttheexpressionchangesofgenesrelatedtocartilageextracellularmatrix，theexperimentwasrepeatedthreetimes.TheobtaineddatawasanalyzedwithGraphPadPrism6.0fortwo-tailedunpairedttest,P0.05meansthedifferencehasstatisticallysignificant.
ResultsHEstainingresultshowedthatalargenumberofchondrocytesandsmallcartilagelacunawereseeninchondrocyesandmaterialsmixturetissuesafter5weeksofinvitroculture.After10weeksofinvivocultivation,obviouscartilagelacunawereformedintheengineeredcartilagetissues;TherelativeexpressionlevelofFBN1mRNAinengineeredcartilagetissue(0.±0.)wassignificantlylowerthanthatinnormalpigauricularcartilagetissues(0.±0.),andthedifferencehasstatisticallysignificant(t=4.,P=0.);FBN1innormaltissuesweredistributedincartilagelacunaandcartilagemembrane,whiletheengineeredcartilagetissuesweremostlydistributedintheperiosteum,andtheclosertothecenterofthecartilagetissue,theless.TherelativeexpressionofFBN1mRNAintheFBN1overexpressiongroupswas0.±0.,whiletheemptyvectorcontrolgroupswas0.±0.,thedifferencehavestatisticallysignificant(P0.,t=9.).AfteroverexpressedFBN1,therelativeexpressionlevelsofcartilage-relatedgenes:SOX9,COL2A1,ACANinchondrocyteswereincreasedto1.±0.,1.±0.,1.±0.times,andthedifferencehavestatisticallysignificant(t=3.,3.,3.;P=0.,0.,0.).
ConclusionsFBN1mRNAexpressionandproteinexpressioninengineeredcartilagetissueconstructedwithpigauricularchondrocyteswassignificantlylowerthannormalauricularcartilagetissue;invitroexperimentsshowthatFBN1promotestheexpressionofcartilage-relatedgenessuchasCOL2A1,ACANinchondrocytes.
Tissueengineering;Cartilage;Fibrillin1;Chondrocytes
Fundprogram:NationalNaturalScienceFoundationofChina();CAMSInnovationFundforMedicalSciences(CIFMS)(-I2M-1-)
DisclosureofConflictsofInterest:Theauthorshavenofinancialinteresttodeclareinrelationtothecontentofthisarticle.
EthicalApproval:EthicalapprovalwasgivenbytheMedicalEthicsCommitteeofPlasticSurgeryHospital,ChineseAcademyofMedicalScience(-37).
利用组织工程化软骨治疗先天性小耳畸形的临床应用已有报道［1］，但在后期的随访中，我们发现组织工程化弹性软骨的力学特征仍然与正常耳廓有较大差距，这也是制约其进一步在临床推广应用的主要问题之一。耳软骨是一种弹性软骨，以富含弹性纤维区别于透明软骨和纤维软骨。文献报道，弹性纤维的主要成分为微纤维和弹性蛋白，而微纤维又由大量原纤维蛋白1（fibrillin1，FBN1）及少量原纤维蛋白2（fibrillin2，FBN2）组成。FBN1在弹性纤维表达中发挥重要的作用，但是在工程化弹性软骨的构建和弹性评估中，还未受到足够的重视［2-3］。本研究中，我们在组织和分子水平上检测了FBN1在工程化弹性软骨组织及正常耳软骨组织中的表达差异，并且在软骨细胞中过表达FBN1，明确其对软骨细胞特异性细胞外基质表达的影响，证实FBN1在弹性软骨组织构建中的作用，为工程化弹性耳软骨构建研究提供参考依据。
材料与方法
一、主要实验材料与仪器
（一）实验动物
雌性健康长枫杂交猪3只，6个月龄，体质量15kg，由北京实创世纪小型猪养殖基地提供，清洁级，实验动物质量合格证号：30。裸鼠3只，8周龄，体质量25g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，SPF级，实验动物质量合格证号：11400348711。
（二）主要试剂
细胞培养及过表达试剂：高糖DMEM（HyClone），胎牛血清、0.25%胰酶（Gibeco，USA），0.2%胶原酶Ⅳ（Sigma，USA），质粒提取试剂盒（Thermo,USA）、jetPRIMEDNA转染试剂（Thermo,USA)。RNA提取及qPCR试剂：Trizolreagent（LifeTechnology,USA），三氯甲烷、异丙醇（北京化工厂），70%乙醇（北京贞玉民生药业），2×SYBRqPCRMasterMix(Swiss,Roche公司)及其他逆转录相关试剂、DEPC水。免疫组化试剂：4%多聚甲醛组织固定液、pH6.0柠檬酸钠抗原修复液、0.5%TriztonX、DAB显色液（上海碧云天生物技术有限公司），30%蔗糖溶液（北京索莱宝科技有限公司），3%H2O2（智强创新科技有限公司），10%山羊血清（Thermo,USA），anti-FBN1抗体（ab,Abcam,USA），Goatanti-RabbitIgGHL（HRP）（ab90,Abcam,USA）。
（三）主要仪器
普通台式离心机（Sigma，Germany），饱和湿度恒温CO2细胞培养箱（Thermo，USA），光学显微镜（Olympus，BX51，Japan），倒置相差显微镜（Nikon，ECLIPSETS，Japan），Nanodrop0超微量分光光度计（thermo，USA），LightCycler实时荧光定量PCR仪（Roche，Swiss），PCR仪（BIORAD，Mexico）。
本研究经中国医医院伦理委员会批准（-37）。
二、实验方法
（一）猪耳廓软骨细胞的提取及培养
采用戊巴比妥麻醉3只长枫杂交猪，剃除猪耳周围的毛发，以乙醇纱和碘伏擦拭2次消*，无菌条件下取单侧猪耳廓3只。75%乙醇浸泡30min，PBS清洗，用剪刀钝性分离得到大小为8cm×5cm的猪耳软骨，在50ml离心管中用PBS清洗5次。于10cm细胞培养皿中将耳软骨剪成2mm×2mm的小块，0r/min，离心5min，离心半径为15cm（下同），去上清，加5倍体积的0.2%胰酶，37℃、以80r/min速度摇床摇30min。0r/min，离心5min，去上清，加5倍体积的Ⅳ型胶原酶，37℃、80r/min条件下摇床摇8h。用70μm细胞筛过滤消化液，0r/min离心5min，获得细胞沉淀。用10%FBS的高糖完全培养基重悬细胞，按3×/ml接种在6孔板中，在5%CO2、%饱和湿度培养箱，37℃下培养，当细胞达80%汇合后，用0.25%胰酶消化，传代或冻存备用。
（二）构建猪耳软骨细胞工程化软骨
参照文献［4］的方法构建猪耳软骨细胞工程化软骨组织。将第2代猪耳软骨细胞在10%FBS的高糖完全培养基中，在37℃、5%CO2、%饱和湿度培养箱中培养，每3d更换新鲜培养基。细胞达80%汇合后，用0.25%胰酶消化，0r/min离心5min，获得细胞沉淀，以6.0×/ml的密度（μl）接种于直径10mm、厚2mm的聚羟基乙酸-聚乳酸（PGA-PLA）支架材料（图1）上，将细胞材料混合物置于含10%FBS的高糖DMEM培养液中培养，每周换液3次，体外培养5周，构建9块细胞材料混合物组织块。随后，将3块组织块用4%多聚甲醛固定，用于HE染色；将6块细胞材料混合物植入3只裸鼠体内构建组织工程化软骨。取裸鼠颈后切口，切开至皮下，用止血钳分离皮肤形成囊袋，以PBS冲洗构建的组织块后，用镊子将组织块植入囊袋中颈部两侧处，每只裸鼠植入2块，10周后取出6块组织工程化软骨。
（三）工程化软骨组织HE染色
取方法（二）中构建的体外培养5周（vitro5w）的细胞材料复合物及体外培养5周、体内培养10周（vitro5w+vivo10w）的工程化软骨组织各3块，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚8μm，于65℃烘箱中烤2h，梯度二甲苯、乙醇脱蜡，自来水中清洗3次后，苏木素染色10min，自来水冲洗1min，0.5%盐酸乙醇快速分化，返蓝1min，伊红染色30s，梯度乙醇脱水后晾干，中性树脂胶封片后，显微镜下观察、拍照。
（四）猪耳正常软骨及工程化软骨组织RNA提取及实时荧光定量PCR
取3只猪另一侧耳廓2cm×1cm大小的软骨组织及3份1.0cm×0.5cm大小的工程化软骨于液氮中冻存。在去除RNA酶的研钵中倒入液氮，研磨软骨至粉末状，加入1mlTrizol，用Trizol法提取组织RNA。用Nanodrop0超微量分光光度计检测RNA的纯度及浓度。以Oligo（dT）15Primer为引物，ngRNA为模板，M-MLV为反转录酶，dNTPmix为原料，用PCR仪进行逆转录反应，合成cDNA。构建20μl体系，进行PCR扩增：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃复性及延伸30s，循环40次，60～95℃溶解曲线分析，用LightCycler实时荧光定量PCR仪获取并分析数据。以Gapdh为内参基因进行标准化，采用2-△△CT法进行相对定量的计算。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，引物序列见表1。实验重复3次，每次3个复孔，结果取平均值，用GraphPadPrism6.0统计绘图。
（五）免疫组织化学染色
分别取0.5cm×0.5cm大小的另一侧猪耳廓软骨组织及工程化软骨组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成10μm厚的石蜡切片。将切片置于65℃烘箱中烤2h，梯度二甲苯、乙醇脱蜡，自来水中清洗3次后，用pH6.0的柠檬酸钠抗原修复液于微波炉中微波3min、解冻10min进行抗原修复。待抗原修复液冷却至室温，取出切片，PBS小心洗3次。3%H2O2常温孵育10min，PBS洗3次，0.5%TritonX孵育30min，PBS洗3次，10%山羊血清室温封闭45min，倾去山羊血清，用纸将切片周围擦净，在组织周围用油性笔画圈。anti-FBN1抗体稀释25倍，4℃孵育40h，室温复温15min，PBS洗3次，anti-RabbitIgGHL（HRP）稀释倍，37℃孵育30min，PBS洗3次，DAB于显微镜下显色，PBS清洗终止显色，复染后用中性树脂胶封片，光学显微镜拍照，每组设置3个生物学重复。
（六）FBN1过表达慢病*载体构建及病*包装
由北京合生基因科技有限公司合成过表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1。菌液扩增后，用质粒提取试剂盒提取空载体质粒及FBN1过表达质粒。按照5μg质粒、10μl转染试剂、μl转染试剂buffer的体系转染第2代软骨细胞，上述体系混匀后进行离心，r/min，10s，室温静置10min，均匀滴入6孔板中，转染24h后更换新鲜完全培养基。37℃、5%CO2、%饱和湿度培养箱中培养约48h，用Trizol收取RNA，逆转录，利用实时荧光定量PCR检测软骨相关基因mRNA相对表达量。实验设置每组至少3组生物学重复，每个基因设置3个复孔，结果取平均值，用GraphpadPrism进行统计绘图。
三、统计学分析
采用GraphPad6.0、ImageJ等软件进行数据处理，各组间比较采用双尾非配对t检验，P0.05为差异具有统计学意义。
结果
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